冻存保护剂对低温保存的组织工程骨修复骨缺损的影响

冻存保护剂对低温保存的组织工程骨修复骨缺损的影响

作者：蓝旭，葛宝丰，刘雪梅

作者单位：兰州军区总医院脊柱外科，甘肃 兰州 730050

【摘 要】 目的 探讨不同方法低温保存的组织工程骨修复节段性骨缺损的差异。方法 以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，MSCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，组织工程骨分别用添加或不添加冻存保护剂的保存液于-80℃深低温冻存3个月，3个月后复温 冻存的组织工程骨。选择60只新西兰白兔，制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型，实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组。A组：骨缺损区植入添加 冻存剂保存的组织工程骨；B组：骨缺损区植入未添加冻存剂保存的组织工程骨；C组：骨缺损区植入未行低温保存的组织工程骨；D组：骨缺损区植入部分脱蛋白 骨。术后4、8、16周取材，行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。结果 术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成，成骨量随时间的推移而增加。经X线、组织学和生物力学评估，A组与C组比较未见差异 (P>0.05)，A组或C组分别与B组和D组比较，成骨能力依次为：A或C> B > D(P<0.001，P<0.05)，其中A或C组术后16周骨缺损完全修复，骨髓腔再通，生物力学性能接近正常骨。结论 选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。

Effect of repair of bone defect by tissue engineered bone cryopreserved by cryopreservation medium

LAN Xu,GE Baofeng,LIU Xuemei

(Department of Spine Surgery,General Hospital of Lanzhou Military Command,PLA,Lanzhou 730050,China)

Abstract： Objective To study the difference of repairing segmental bone defect by tissue engineered bone cryopreserved by various methods.Methods MSCs were cocultured with partially deproteinized bone to produce tissue engineered bone.The tissue engineered bone had been cryopreserved at -80℃ with or without cryopreservation medium for 3 months and thawed 3 months later.The experimental model of 15mm radial segmental defect was produced in 60 New Zealand white rabbits，which were divided into A,B,C,D groups according to different transplant materials.Group A:The bone defects were repaired by tissue engineered bone stored in preservation solution with cryopreservation medium.Group B: The bone defects were repaired by tissue engineered bone stored in preservation solution without cryopreservation medium.Group C: The bone defects were repaired by tissue engineered bone without cryopreservation.Group D: The bone defects were repaired by partially deproteinized bone.When the samples were harvested 4,8,16 weeks postoperatively,a series of examination were carried out,including the roentgenographical,histomorphological,biome chanical and computerized graphical analysis.Results All of the defects which had been treated with implants exhibited new bone formation 4,8,16 weeks postoperatively,with the time being.There was no difference between the group A and C(P>0.05) ,according to radiological,histomorphological and biomechanical evaluation.The comparision study showed that ability of new bone formation in 4 groups was ranged as follows:A or C>B>D(P<0.001，P<0.05) .After 16 weeks,the defects in group A and C were bridged with the appearance of marrow cavities,the biomechanical property in implants approached to those of normal bone.Conclusion The choice of proper cryopreservation solution could optimize the bioactivity of tissue engineered bone.

Key words：tissue engineering;cryopreservation;bone defect;repair

目前，国内外骨库对于异体骨和异种骨的保存积累了丰富的经验，但对于组织工程骨的保存却是一个空白点。相对于异体骨和异种骨的保存，组织工程骨的保存需要更为严格的标准。如何使保存后的组织工程骨具有较好的生物活性，需要进行相关研究。

材料与方法

1 部分脱蛋白骨支架材料的制备取脑死亡患者捐献尸体骨的干骺端，修整为1.5cm×0.5cm×0.3cm大小。材料一侧为皮质骨，另一侧保留部分松质骨， 共80块。生理盐水反复冲洗，-70℃深低温冰箱冷冻，经脱脂、脱细胞和部分脱蛋白处理，冷冻干燥机冻干。材料用双层血浆袋密封包装，环氧乙烷消毒，4℃ 冰箱冷藏保存。

2 组织工程骨的制备和低温保存取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液 （Gibco公司），混匀后加入3ml淋巴细胞分离液（Gibco公司），1800r/min离心10分钟，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以 1×106/ml密度接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90%生长面积时用 0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10-2mol /L β－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液,每个支架材料以 1×106/ml密度接种经诱导培养的MSCs,于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养7天。以含15%胎牛血清DMEM培养液为基本保存液，冻存保护 剂的基本成分为二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO) 、羟乙基淀粉和蔗糖，按照一定的浓度和比例合理搭配。组织工程骨分别用添加或不添加冻存保护剂的保存液于-80℃深低温冻存3个月，3个月后复温冻存的组 织工程骨。具体降温步骤如下：将组织工程骨分装入含不同保存液的冻存管内，室温下放置10~15分钟，然后置于4℃ 20分钟，以-1 ℃/min降温至-20℃，保存30分钟，再以-1 ℃/min降温至-80℃，放入深低温冰箱保存。3个月后取出冻存管，快速置于37℃水浴1~2分钟，直至保存液完全融化。

3 不同移植材料扫描电镜观察各组取组织工程 骨1块，PBS漂洗3遍，戊二醛固定，酒精梯度脱水，标本经干燥和喷金处理后，用扫描电镜观察细胞在材料表面的黏附和分布。扫描电镜观察部分脱蛋白骨的三维形态结构。

4 动物模型和实验分组选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0~2.5kg，由卫生部兰州生物制品研究所提供。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上 肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模 型。实验根据植入不同的材料分为A组：骨缺损区植入添加冻存剂保存的组织工程骨；B组：骨缺损区植入未添加冻存剂保存的组织工程骨；C组：骨缺损区植入未 行低温保存的组织工程骨；D组：骨缺损区植入单纯部分脱蛋白骨。

5 检测项目

5.1 X线检查 术后4、8及16周X线摄片，根据Lane等［1］的X线评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形进行评分。术后4、8及16周处死动物，取尺桡骨全段，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与宿主骨融合和周围软组织分布情况。

5.2 组织学观察 标本经4%多聚甲醛固定后，用10%的EDTA脱钙，常规脱水、浸蜡和包埋，石蜡切片厚度为5μm，行Mansson染色，显微镜下观察移植区的骨愈合情 况。用MLAS医用计算机图像分析系统采集术后4周和16周的组织切片，在4倍物镜下寻找包含移植材料的视野，计算每一视野中材料与材料内所形成新骨的面 积百分比。

5.3 生物力学测定 用万能材料试验机(美国Instron公司)测量各实验组术后16周尺桡骨标本的最大扭转强度，以正常兔的尺桡骨为对照。

6 统计学方法 采用SPSS 10.0软件包对检查结果行多个样本均数的方差分析和两两比较的q检验，P<0.05为有统计学意义。

结果

1 不同材料扫描电镜观察结果各组组织工程骨细胞在材料表面均可黏附，呈梭形或多角形，相邻细胞间有突起相互连接，细胞周围有网状胶原附着。其中， A组和C组材料表面黏附大量细胞，并有较多胶原连接；B组材料表面黏附细胞较少，胶原连接很少；D组部分脱蛋白骨仍保留有原骨的骨小梁、小梁间隙和骨内管 腔系统，骨盐支架的三维结构形态依然存在。

2 X线检查

2.1 X线观察 A组和C组术后4周，截骨端有新骨形成，移植材料纹理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料边界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮质骨与宿主皮质骨自然连 接，显示出正常骨干结构，移植材料分辨不清，髓腔再通。B组和D组术后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料纹理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生长，移植 材料边界不清；16周，髓腔部分再通，骨缺损存留少量移植材料。

2.2 X线评分 移植区骨形成、骨连接和骨塑形的X线综合评分，A与C组比较未见差异(P>0.05)，A组或C组分别与B组和D组比较，成骨能力依次为：A或 C>B>D(P<0.001，P<0.05)，结果见表1。

表1 各组骨缺损修复放射学评估（略）

与A组或C组比较：*P<0.05，**P<0.001

3 组织学观察A组：术后4周，移植材料周围和内部出现大量软骨细胞和成骨细胞，呈岛状生长的新生骨组织贯穿整个移植材料(图1a)；8周，新生骨小梁周围可 见大量成骨细胞和破骨细胞，编织骨向板层骨过渡，移植材料逐渐被新生骨取代，骨髓腔出现；16周，移植材料完全被新生骨取代，骨小梁排列整 齐，皮质骨形 成，骨髓腔再通。B组：术后4周，移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，新生骨桥接移植材料和宿主骨(图1b)；8周，骨小梁周围出现大量成骨细胞和破 骨细胞，移植材料内部出现交错排列的编织骨，骨髓腔出现；16周，新生骨逐渐改建为板层骨，但不完善，骨缺损大部分被修复，仍存留少量移植材料。C组：术 后4周，移植材料周围和内部出现有软骨细胞和成骨细胞形成，材料周围形成大量新生生骨(图1c)；8周，材料周围出现大量成骨细胞和破骨细胞，新生骨增多 并向材料内长入；16周，新生骨逐渐取代移植材料，骨髓腔出现，骨改建尚不完善。D组：术后4周，移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，材料周围形成大 量新生骨，新生骨呈明显的梯度生长，靠近界面端成骨细胞活跃，远离界面的部位成骨较少(图1d)；8周，移植材料周围和内部成骨细胞和破骨细胞聚集，材料 内部出现交错排列的编织骨，新生骨逐渐取代移植材料；16周，移植材料被新生骨取代，骨髓腔出现。

a.移植材料周围和内部出现大量软骨细胞和成骨细胞，呈岛状生长新生骨组织贯穿整个移植材料；b.移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，新生骨桥接移植 材料和宿主骨；c.移植材料周围和内部出现有软骨细胞和成骨细胞形成，材料周围形成大量新生骨；d.移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，新生骨呈明显 的梯度生长

图1 术后4周，各组移植材料修复骨缺损的组织学观察(Mansson染色 ×100)（略）

4 组织形态计量学移植材料植入体内后，随着时间的推移，新骨形成增多，材料逐渐被降解，采集术后4周和16周的组织切片，寻找包含移植材料的视野，计算移植 材料与材料内形成新骨面积百分比，A组与C组比较未见差异(P>0.05)，A组或C组明显低于B组和D组 (P<0.001，P<0.05)，间接推断各组成骨能力依次为：A或C>B>D，结果见表2。

5 生物力学测定术后16周尺桡骨力学强度比较，A与C组比较未见差异(P>0.05)，A组或C组明显高于B和D组 (P<0.001，P<0.05)，A组或C组术后16周尺桡骨力学强度接近正常尺桡骨(P>0.05），结果见表3。

表2 各组骨缺损修复组织形态学分析（略）

与A组或C组比较：*P<0.05，**P<0.001

表3 各组骨缺损修复生物力学分析（略）

与A组或C组比较：*P<0.05，**P<0.001

讨论

低温冻存是保存活体组织的重要方法，冷冻损伤是活体组织细胞最主要的负反应。损伤机制主要是冻融时冰晶对细胞的机械性和渗透性损伤，表现在以下2个方面 ［2，3］：（1）慢速冷冻过程中，细胞外液水分不断结晶造成游离水分减少，导致细胞内外渗透压不等，使得大量水分由细胞内向细胞外渗出，逐渐导致细胞内 渗透压升高，造成“溶质性损伤”。（2）快速冷冻过程中，细胞内水分尚未转移到细胞外，而细胞内外同时结冰，细胞内冰晶机械性破坏细胞器和细胞核而导致细 胞损伤，造成“细胞内冰晶损伤”。目前认为生物组织的冷冻损伤主要是“溶质性损伤”所产生的渗透压、电解质含量和pH值的改变作用于细胞膜脂质造成的细胞 膜渗漏。在复温过程中，细胞膜渗漏使大量水分进入细胞内导致细胞水肿而死亡，称为渗透性休克［4］。此外，复温过程中如复温速率较慢，则会再次形成冰晶加 重细胞损伤。由于冷冻速率越快引起细胞内冰晶形成越多，而速率过慢又可导致“溶质性损伤”。因此，低温保存需要选择造成损伤最轻的降温速率。此外，复温速 率对低温保存后细胞活力的恢复有很大影响，严格说复温过程是降温过程的逆函数［5］。如果没有足够快的复温速率，细胞内再次形成冰晶的概率很高。为了减轻 冷冻损伤，选择适宜的降温和复温速率是低温保存的一个关键环节。分阶段降温比匀速降温对细胞活力和功能影响小，因此本实验采用分阶段降温措施，降温速度 1~1.5℃/min，3个月后快速复温，较好地保持了冻存细胞的活力和功能。冻存保护剂是减少冷冻损伤的另一个重要方法，其保护机制可能是防冻剂与水分 子形成氢键，使最低共熔点降低，从而减轻或避免了冷冻复温过程中冰晶对细胞的损伤［6］。由于各种冻 存保护剂的作用机制不同，单一保护剂很难达到效果理想 的冷冻保护要求，目前常采用多种冻存剂组成的混合保护剂。本实验采用含15%胎牛血清的DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为DMSO 、羟乙基淀粉和蔗糖，3种成分按照一定浓度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和渗透性强等特点，有助于细胞克服低温保存过程中细胞内外渗透压剧烈变 化引起的损伤，是目前最常采用的冻存保护剂［7］。其作用机制是：DMSO在细胞冷冻前渗透到细胞内，可降低培养液冰点并防止游离蛋白质聚集，提高细胞膜 对水的通透性。冷冻前渗透到细胞内的DMSO在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同 时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞结构过度脱水皱缩［8］。羟乙基淀粉通过竞争结合水的氢原子，使冰晶生成速度减慢，减弱水的固化过程，可以降低细胞外 溶质浓度过高造成的细胞损害［9］。低分子不可渗透物质蔗糖能在降温时向细胞外转运细胞胞内溶质，而复温时则作用相反，从而减轻细胞渗透性损伤［10］。 目前对于混合性冻存剂的研究主要是寻找对相应组织和细胞具有保护效果最佳、毒性最小、不同种类和不同含量冻存剂的组合。本实验采用DMSO 、羟乙基淀粉和蔗糖混合物为组织工程骨的冻存保护剂，结果添加冻存剂组与不添加冻存剂组相比较，复温后的组织工程骨生物活性得到了极大程度的改善，与未行 低温保存的新鲜组织工程骨相比较，其修复骨缺损的能力未见明显下降。保存组织工程骨所应用的降温复温程序和速率、冻存剂含量和配方的选择如何才能做到最 佳，并且方法简便、经济和实用，这些方面均有待于进一步研究。

【参考文献】

［1］Lane JM,Sandhu HS.Current approaches to experimental bone grafting［J］.Orthop Clin North(Am),1987,18(2):213-225.

［2］Brien FJ,Harley BA,Yannas IV,et al.Influence of freezing rate on pore structure in freezedried collagenGAG scaffolds［J］.Biomaterials，2004,25(6):1077-1086.

［3］ Windrum P,Morris TC,Drake MB,et al.EBMT chronic leukaemia working party complications subcommittee. variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT centres［J］.Bone Marrow Transplant,2005,36(7):601-603.

［4］Kotobuki N,Hirose M,Machida H,et al.Viability and osteogenic potential of cryopreserved human bone marrowderived mesenchymal cells［J］.Tissue Eng,2005,11(5-6):663-673.

［5］Ji L,Pablo JJ,Palecek SP.Cryopreservation of adherent human embryonic stem cells［J］.Biotechnol Bioeng,2004,88(3):299-312.

［6］Kofron MD,Opsitnick NC,Attawia MA,et al.Cryopreservation of tissue engineered constructs for bone［J］.J Orthop Res,2003,21(6):1005-1010.

［7］罗晓中,杨志明,邓力,等.组织工程骨低温保存后修复兔骨缺损的影像及形态学分析［J］.中华创伤骨科杂志,2004,6(3):744-747.

［8］ Ebertz SL,McGann LE.Cryoprotectant permeability parameters for cells used in a bioengineered human corneal equivalent and applications for cryopreservation［J］.Cryobiology,2004,49(2):169-180.

［9］ Gole MD,Poulsen D,Marzo JM,et al.Chon drocyte viability in pressfit cryopreserved osteochondral allografts［J］.J Orthop Res,2004,22(4):781-787.

［10］Kruyt MC,Bruijn JD,Yuan H,et al.Optimization of bone tissue engineering in goats: a peroperative seeding method using cryopreserved cells and localized bone formation in calcium phosphate scaffolds［J］.Transplantation,2004,77(3):359-365.