卵巢移植和冷冻保存技术在生殖领域中的应用
摘要：卵子是一种宝贵的生殖资源，它不象精子那样易获得和好保存，过去关于保存母本遗传物质的研究主要倾向于冷冻保存卵母细胞的方式，而对其它的一些保存方式，如:卵巢移植和卵巢冷冻保存的方法研究相对较少，并且这两种方法在近来也成为生殖领域中的研究热点，本文就主要根据自己在这方面的一些简单研究，做一点关于卵巢移植和冷冻保存的简单综述。
卵巢冷冻和移植被认为是将来建立卵子库的一项新技术。它对那些由于癌症而接受放化疗的幸存者想要再进行生育，以及对一些濒危动物的保种方面是非常有价值的。早在1932年Aldous Huxley就预言到冷冻的卵巢组织移植在人类的试管生殖中的运用，该技术就是现在所说的体外受精和克隆（Huxley，1932） ［1］ 。上世纪五十年代起科学家们就对卵巢移植技术表现出浓厚的兴趣，并开展了广泛的研究，而新近发展的技术如卵巢组织低温冷冻技术、免疫抑制技术和利用血管生长因子促进新植入组织血管再生技术等，更加促进了卵巢移植技术的发展。除了利用冷冻卵子用于辅助生殖外，移植捐赠卵巢也将用于治疗不孕妇女、绝经妇女（Torrents，et al，2003） ［2］ 、患子宫癌的妇女或因放疗化疗引起卵巢衰竭的妇女（Falcone，et al，2004） ［3］ 。本文将着重讨论卵巢低温冷冻和移植技术的发展和在生殖领域中的一些运用与价值。
1 卵巢低温冷冻和卵巢移植技术的概况
由于克隆、转基因、辅助生殖等新技术的出现和不断发展，人们对人卵以及其它珍惜动物卵的需求越来越大。卵巢组织的低温冷冻技术的发展最初就是为建立卵子库，满足人们对卵的不断需求。另外，它们在防止因放疗化疗、疾病或年龄增长引起的卵母细胞的损伤等方面也具有重大的实际意义。卵巢的低温冷冻可以用来帮助妇女恢复生育能力，在不用激素代替疗法（HRT）时使卵巢也能正常地分泌激素。关于该技术发展的最早报道仅仅是十几年前（Gos-den，et al，1994） ［4］ ，但是科学家们对此新技术却是在最近几年才显示出极大的兴趣。近年来卵巢移植也成为科学家们研究的热点，它与卵巢的低温冷冻具有密不可分的关系。有人把人类卵巢组织异种移植到有免疫缺陷的老鼠体内也能存活（Gunasena，et al，1997） ［5］ ，并且把老鼠卵巢移植到老鼠体内已经有了产仔的报道。关于人类的实验也正在进行中，据维吉尼亚的研究者们报道，他们把猴子的卵巢组织摘除，然后在它们的前臂植入卵巢组织，此方法可以维持猴子的卵巢的功能、月经周期和排卵。更重要的是研究者们在前臂的卵巢组织中还能重新找到成熟的卵母细胞，表明这些卵母细胞可能可以进行体外受精并生产下一代。那些移植了冷冻过的卵巢组织的猴子中大约有一半可以恢复卵巢功能（Schnorr，et al，2002） ［6］ 。虽然经卵巢组织移植的老鼠和绵羊已经生产出下一代，猴子和人的移植卵巢组织也能分泌性激素，但到目前为止猴子和人还没有通过此方法成功地繁殖出下一代，但至少可以说明这种方法的可行性。最近Lee和他的同事们（2004） ［7］ 报道了首例成功地把新鲜的卵巢组织植入猴子身体的不同部位，使这些卵巢产生成熟卵母细胞并受精，再将受精卵移植到代孕母猴，最终生下了一只健康的雌性小猴。这个异位移植的卵巢组织没有经过外科手术使之与大血管相连，但是仍能正常生长并发挥其功能，它的成功为人类的卵巢移植试验奠定了基础。虽然早期的人类试验做的很少而且也没有成功受孕的报道，但是卵巢移植技术还是给人们带来了希望，因为移植的卵巢可以持续的产生激素，那就可以取代激素疗法。可以避免因为激素治疗带给人们不可预知的一些副作用，同时也可以避免因卵巢衰竭提前进入更年期给女性所带来的一些烦恼。随着科技的进步和科学家的不断努力，最近几年一些试验结果又给人们带来一线希望，利用此方法有一个移植卵巢产生了第一个人类胚胎。Kutluk Oktay和他的同事从一个得了乳腺癌的三十岁妇女身体中取一小块卵巢组织，这些组织是在化疗前组织还没被破坏，卵巢功能还没衰退的时候取出的。然后经过冷冻保存，六年以后当病人进入绝经期时，再把这个卵巢组织重新植入她的腹部皮肤下。大约三个月后，这个组织又获得正常的功能并开始排卵，这些卵母细胞在体外受精成功并且发育成一个很有希望成活的胚胎。但是四细胞的胚胎没有发育成功，这也没什么奇怪的，因为即使在最好的条件下利用常规的体外受精技术培植成活一个四细胞胚胎的几率也只有十分之一（Oktay，et al，March2004a） ［8］ 。最近的临床研究表明经过长期冷冻保存的卵巢组织重新植入绝经妇女身体后，卵巢的内分泌功能和卵母细胞受精能力都可以恢复。
2 卵巢的冷冻保存和移植技术
除了年龄增长，许多化学条件也会破坏妇女卵巢中的生长卵泡。这些化学条件包括卵巢癌和化疗或放疗引起的卵泡损伤。男人终生都可以产生精子，而女人在出生时卵泡的数量就已固定，基本确定了她们的生育年限，这一观点已被普遍接受。任何加速卵泡损伤的因素都会使绝经期提前。精子的低温冷冻技术已经应用了几十年，卵巢低温冷冻技术却因为无法保证细胞冻融过程中保持卵母细胞质和细胞核的完整性而阻碍了其发展应用（细胞在冻融过程容易死亡是众所周知）。随着辅助生殖技术如体外受精技术的出现，使卵母细胞或胚胎冷冻成为可能，因为在月经期的特定时间用激素处理就可以获得卵母细胞。用该方法可以收获大量卵子以备后用（建立卵子库），这有利于那些想推迟到三四十岁再生小孩的妇女。实验证明冷冻保存技术是可行的，绵羊的卵巢组织冷冻两年后再移植仍然可以保持功能（Baird，et al，1999） ［9］ ，而老鼠的卵巢组织经冷冻保存和自体移植后卵泡的存活率大约有50%～75%（Nugent，et al，1997） ［10］ 。
2.1 卵巢的低温冷冻 冷冻卵巢组织是一种保存配子的简单方法，卵巢组织中含有大量的抗冻性好的原始卵泡。原始卵泡抗冷冻伤害的原因可能是由于它的尺寸小，处于有丝分裂的休眠期，代谢水平低等原因。早期开展卵巢低温冷冻保存研究的主要是Deansley ［11］ 、Parkes ［12～14］ 、Par-rott ［15］ 。在二十世纪五十年代就有人用甘油做冷冻保存剂冷冻卵巢组织。Parkes和Smith ［14］ 试图用慢速降温法在含有15%甘油的冷冻液中冷冻保存大鼠卵巢组织切片（1mm 2 切片），经移植后部分受体可恢复动情周期。
2.2 卵巢移植 移植到前臂的人类卵巢组织可以产生了滤泡，并可以用针刺激卵泡恢复。移植到前臂的卵巢组织血管化良好，它可以更快的恢复功能并显示出长期机能。但是卵巢组织移植到前臂就不能进行自然受孕，需要把从前臂重新得到的卵母细胞利用人工授精技术进行辅助生殖。虽然卵巢移植物存活的时间还待确定，但是一小片卵巢皮层可以成功移植并长出无数个卵泡。卵巢刺激的每个周期里，卵巢组织首先由卵泡刺激素（FSH）和人类绝经期促性腺激素混合物诱导，卵母细胞的最终成熟可由人绒（毛）膜促性腺激素诱导（hCG）。利用该技术36～40h后可以获得成熟的卵母细胞并可以进行胞质内精子注射（Oktar，et al，2004b） ［16］ 。
2.2.1 卵巢自体移植 卵巢自体移植就是把卵巢移植回捐赠者自己体内的方法。这样可以移植到卵巢以前生长的附近或者到其它部位。自体移植有几个方面的优势。首先，这些捐赠的卵巢组织有许多好的原始卵泡。1mm 3 卵巢皮层可能包含有成百上千的卵母细胞 ［17］ 。这样卵巢组织的低温冷冻就具有更多的成功潜力。其次，卵巢组织自体移植理论上可以保持女性的内分泌功能，不想IVF和卵母细胞冷冻仅满足了人们的生殖能力。再者，卵巢低温冷冻保存不象低温保存胚胎或者卵母细胞那样耽误癌症的治疗。卵巢组织切除或者卵巢活组织检查常常易进行，卵巢恢复时间快。第四，原始卵泡由不成熟的卵母细胞周围包围一层单层扁平颗粒细胞。这些细胞体积非常小，代谢活动低，卵母细胞不会被阻止在纺锤体出现的阶段。所以这些特征都证明它比成熟卵母细胞更适合低温保存。最后，解冻，移植不成熟卵母细胞通过在体成熟，消除了对外源激素刺激的需要。
2.2.2 卵巢异种异体移植 卵巢异种异体移植可以避免低温冷冻保存而发生的卵泡大量流失，提供了几个理论上的优势，包括继续监控移植物状况的能力 ［18］ 。成功的动物卵巢异种异体移植受体可以每天进行雌激素的产生、促性腺激素的水平和用超声波扫描得到的卵巢功能的其它参数。理论上异种异体移植的卵巢也可以被用做扫描癌症病人的一些未知的疾病。卵巢异种异体移植是卵巢低温冷冻保存的又一种选择方法。卵巢异种异体移植包括移植卵巢从一个物种到另一个物种。在这里有一个潜在的担心，就是通过卵巢移植把癌症又带回给人们。因此，研究者们开始探索把卵巢组织移植给其它动物宿主。通过这种方法癌症传播和复发的可 能性得到降低，因为原始卵泡成熟的过程是在动物受体中进行的。另外，卵巢异种异体移植可能对那些卵巢刺激有困难的人是有益的。皮下移植具有许多优点，如移植程序简单、卵泡发育监控容易和方便。然而，卵巢异种异体移植应引起一些伦理上的考虑;人卵母细胞在其它物种里面成熟的概念对一些来说是讨厌的。而且，异种异体移植提高了物种间传染病传播的可能性或者潜在地人类基因组的改变，因此还需要进一步的研究。
&nbs p; 3 卵巢移植低温冷冻保存与人类生殖
随着辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的发展，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）、供卵、构建卵子库、人类胚胎干细胞、卵泡发育生理和卵巢毒理学的实验研究等均需应用大量卵子。由于人卵来源有限，大多数治疗机构都存在卵子供不应求的状况。虽然未成熟卵母细胞体外成熟（in vitro matu-ration，IVM）技术有一些进展，但也还是远远不能满足需求，并且也只能对腔前卵泡进行培养，对原始卵泡的培养在人上还没有成功的报道，目前原始卵泡的培养仅在小鼠获得存活后代 ［19］ 。而卵巢移植和低温冷冻保存可以更好地解决这些问题，具有十分诱人的前景。对于年轻的生殖器肿瘤患者或接受化疗、放疗的其他肿瘤患者以及因妇科疾病需切除性腺者，治疗后往往出现卵巢早衰和丧失生育能力，影响生活质量。卵巢移植的过程包括在化学治疗前摘除和冷冻病人的部分卵巢组织。化学治疗结束后卵巢组织重新移植回人体帮助恢复卵巢功能。这样，卵巢组织的冷冻保存和移植就成为这些病人预防生殖能力丧失的最好选择，并且事实证明动物和人的卵巢组织片能够耐受冷冻保存的那些程序。卵巢组织成功移植后，在动物和人的试验中都可以观察到卵泡的生长和激素的分泌（Torrents et al.，2003） ［2］ 。科学家们仍在继续研究以优化卵巢组织的冷冻保存技术，将来，病人既可以建立卵巢组织库用于以后辅助生殖（如人工授精）或者作为激素代替疗法（HRT）的替代治疗。但是许多癌症病人在人工授精前就开始治疗了，因此许多年轻或未婚妇女找不到异性为她们提供精液使卵母细胞受精。随着新冷冻技术的发展，冷冻保存卵巢组织或者卵母细胞是一个很好的办法，并且已经有采用这种方法成功受孕的报道。
4 卵巢冷冻和移植存在的问题
卵巢冷冻和移植受到外界和内在许多因素的影响，虽然目前有一些成功的案例报道，但还不是很多，目前仍只是在探讨阶段。还需要进一步的实验去证明。（1）卵巢冷冻后移植回收率低，卵巢经冷冻移植后回收时，并不能完全回收到我们需要的卵巢，不知道是由于冷冻还是因为移植而被排斥掉。我们在移植中发现，一般只有一半左右的回收率。（2）冷冻不是很方便，若卵巢较小就好操作和冷冻，太大了就不易冷冻，需要切小，冷冻移植时给回收也带来许多麻烦。（3）卵巢组织移植时，会不会把癌症等一些疾病带给受体，或者受体会不会把疾病传染给卵巢组织，移植的卵巢组织在受体中生长会不会发生一些其自身特点的改变。这些也都是卵母细胞成熟时考虑的问题。（4）卵巢移植的受体不好找，在动物上还可以把动物的卵巢移植老鼠身上，而把人的移植到动物身上在临床上还不能让人接受，只有移植到供体自己身上，但这样给患者也带来许多不方便。（5）当然这些新技术也产生了很多伦理道德问题。例如，建立卵子库使女性们推迟到中年后再生育小孩，近年来卵巢冷冻保存和移植技术的进步使绝经后妇女恢复生育能力在理论上成为可能，这些事实都预示着人类社会可能会产生史无前例的断代。这些技术引起的道德矛盾一是出于社会经济原因推迟生育小孩，二是推迟到中年生育小孩花费更大，而且对健康不利。此外，卵母细胞在冷冻过程中使用了化学物质，那么来自卵子库的卵子是否绝对安全呢，这个问题还有待确定。
5 展望
卵巢组织冷冻保存和移植是一种及有前景的新技术，在不久的将来它可以运用到临床上帮助解决老龄和患有卵巢癌的妇女们的生殖上的问题。另一种较有前景的技术是把某一个品种动物的卵巢组织放在另一个品种动物体中生长（作为一种异种移植物，如Nisolle等，2000） ［20］ 这种技术已经初露锋芒，即使病人体中有癌变的卵泡也可以用此方法恢复正常卵泡细胞生长而不必担心复苏任何与癌细胞有关的细胞。另外，该技术能更有效地使卵母细胞成熟和功能恢复，从而再用于人工授精，这样在生殖生物学领域将有巨大的现实意义。即使是很小片的活组织切片，如果证明是足够量用于人工授精的，也可以用来建立卵子库以备后用。把激素治疗周期内获得的额外卵子冷冻保存，该技术的进步很快就可用来建立用途广泛的卵子库，就像目前的精子库一样。由冷冻保存的卵母细胞而来的胚胎已经生出正常健康的小孩，并且成功的数目明显超过目前流行的利用冷冻保存的卵巢组织产生卵子来繁殖下一代，所以冷冻保存卵母细胞将会成为辅助生殖治疗的首选。有一个研究表明利用促性腺激素释放素抑制剂抑制卵巢释放激素，在化学治疗过程中可以明显地保护人的卵母细胞。促 性腺激素释放素抑制剂比较便宜，相对安全，而且不易受其它治疗方法的影响。实在没办法就利用捐赠卵子，对于那些无法避免卵巢衰竭的妇女，利用捐赠卵子成功受孕的几率很大。意大利的一个研究小组在卵母细胞冷冻和解冻技术上取得了成功，并顺利地产出了一个健康的小孩（Fabbri，et al，1998） ［21］ 这些技术的进步有助于卵巢低温保存技术的发展，将来卵巢组织移植可能使人类一生都可以生育。
参考文献
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（编辑林 嘉）
作者单位:510642广州华南农业大学动物科技学院
200092上海第二医科大学发育生物学研究中心（ △ 通讯作者）
528000广东佛山佛山科学技术学院生命科学学院
