深低温冷冻技术对带血管同种异体骨移植作用的实验研究

摘要:目的探讨深低温冷冻技术对带血管同种异体骨移植物抗原性的影响,观察移植骨连接情况。 方法健康成年新西兰白兔36只(随机取12只作供体,24只作受体)分3组:A组(受体12只)深低温冷存带肱血管异体桡骨段移植;B组(受体12只)新鲜带肱血管异体桡骨段移植;C组(供体12只)取移植骨段后继续喂养4周,行免疫学检测,为无移植对照组。术后观察吻合血管通畅率,7,28 d检测血清干扰素γ(IFNγ)水平,2,4,8,12周X线检测,12周行移植骨组织学检查。结果A组血管通畅率、移植骨生长速度和骨连接情况优于B组,血清IFNγ水平低于B组,骨皮质浅层及深层骨陷窝内骨细胞存活,炎症细胞浸润不明显,血管管腔通畅,B组移植骨未见存活骨细胞,淋巴细胞、浆细胞浸润明显,血管管腔血栓形成。结论深低温冷冻技术降低带血管同种异体骨移植物的抗原性,移植后显著降低器官的移植排斥反应,有助于吻合血管通畅、移植骨的存活,加快骨连接。

临床上由于外伤、肿瘤或其他原因而导致肢体大段骨缺损始终是骨科的一大难题。目前主要采用灭活的同种异体骨重建骨性结构,骨愈合缓慢,爬行替代时间漫长,生物力学性状差,常导致负重后再骨折,临床效果欠佳[1]。带血管自体骨移植在临床上有确切的疗效,但受到自体骨来源的限制,临床上很多大段骨缺损病人仍得不到很好救治。带血管同种异体骨移植是解决这一难题的出路,但受到机体免疫排斥的影响,临床应用受到很大限制[2]。采用深低温冷冻技术,可以降低移植骨的抗原性,使带血管同种异体骨移植修复肢体大段骨缺损的突破成为可能。

1材料与方法

1.1动物及分组健康成年新西兰白兔36只,体质量2.0~2.5 kg,雌雄不限[上海市松江区松联实验动物场,合格证号:SCXK(沪)20020012]。随机取12只作供体,24只作受体。分为3组:A组(受体12只),为深低温冷存带肱血管异体桡骨段移植;B组(受体12只),为新鲜带肱血管异体桡骨段移植;C组(供体12只)取移植骨段后继续喂养4周。

1.2建立带血管同种异体骨移植动物模型

1.2.1深低温冷存带血管的异体桡骨段的制备[3]A组氯胺酮(50 mg/kg)与地西泮(5 mg/kg)混合液肌注麻醉。备皮、常规消毒,取前肢内侧正中切口约5 cm,近端越过肘部,沿肱二头肌内侧缘分离,暴露血管神经束,剪断二头肌腱及旋前圆肌腱,沿血管神经束向下分离,逐步显示肱血管及其分支,顺桡动脉分支至入桡骨处,保留肌袖约0.5 cm,以血管入桡骨处向远端约1 cm处锯断桡骨,游离桡骨近端至肘关节处,切断肱血管,整段取出桡骨。立即用4 ℃低温保存液(UW液)冲洗血管床,直到流出液清亮。再用4 ℃低温保护剂15％二甲亚砜(DMSO)灌注血管床,冲洗和灌注时间<5 min,压力<60 mmHg(8 kPa,1 mmHg=133.3 Pa)。然后将桡骨段置于充满15％DMSO的深低温冷冻瓶,放入4 ℃冰箱20 min后取出,置入程序降温仪后,置于-86 ℃深低温冰箱,逐步降温。冷冻1周后备用。B组:带肱血管的异体桡骨锯取、冲洗血管床后,直接移植到供体。

1.2.2吻合血管的异体桡骨段移植在麻醉与无菌条件下,分离出正中血管,阻断钳阻断血流,从远端剪断血管,以备吻合。锯取受体兔桡骨近段约1.8 cm,形成骨缺损。深低温冰箱中取出桡骨段经37 ℃恒温水浴中复温,不超过3 min,用UW液冲洗桡骨段,并经肱动脉,冲洗血管床3~5 min,根据缺损长度锯取相同长度异体桡骨段移植嵌插入受骨区,如异体骨长度偏长,用骨锉去除部分骨质,同时骨锉可以修整断端,使骨块对位更理想。如不牢固可用4号丝线捆扎于同侧尺骨上。分别将供体肱静脉与受体正中静脉、肱动脉与正中动脉在10倍手术显微镜下以110无损伤缝合线作端端吻合,见血流通过吻合口、血管搏动后,闭合伤口。

1.2.3术后处理不做内外固定,自由活动,分笼饲养。肌注青霉素5万U/kg,1/d,共7 d,肠溶阿司匹林250 mg+潘生丁25 mg溶于水中灌服,共7 d。注意观察饮食、粪便、切口情况。

1.3观察内容

1.3.1大体情况术后肢体肿胀、伤口愈合情况;术后12周处死动物前通过勒血实验及血管内注射墨汁,了解吻合血管通畅情况。

1.3.2免疫学检测术后第 7、28天检测血清干扰素γ(IFNγ)水平,用细胞因子试剂盒(华美生物工程公司)双抗体夹心ELISA法检测。清晨空腹从兔耳缘静脉抽取静脉血2 mL,低温离心(4 ℃,3 500 r/min,10 min),分离血清装于另一支离心管中,在-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3X线检测术后第2,4,8,12周拍摄X线片(条件为40 kV,40 mA,0.04 s),观察骨痂生长及骨连接情况,着重观察移植结合部、移植骨周围骨痂生长情况。

1.3.4组织学检查术后第12周处死动物前切取移植骨,包括两端骨连接处,10％甲醛固定,混合脱钙48 h,石蜡包埋,HE染色。光学显微镜下观察骨愈合、骨细胞生长和炎性细胞浸润等情况。

1.4统计学处理血清IFNγ实验数据以x±s表示,各组间检测值做SNKq检验。

2结果

2.1大体情况A、C组各有1只死于麻醉意外,予以补充。术后肢体肿胀一般于2周后消失,伤口愈合良好。A、B组各有1只伤口感染,经消炎、换药处理后伤口愈合,C组未发现伤口感染。血管通畅率A组8只通畅,通畅率66.7％,B组0只通畅。

2.2免疫学检测术后第7、28天3组IFNγ水平见表1。表13组术后血清干扰素γ水平pg/mL

2.3X线检查术后第2周A、B组均未见骨痂,骨折线清晰可见。第4周A组可见少许骨痂,骨折线较模糊,以近端为著,而B组无明显骨痂生长。第8周,A组骨痂明显增多,有连续性桥接骨痂,骨折线接近消失,而B组小部分有骨痂生长,骨折线模糊。第12周A组大部分骨折线基本消失,周围骨痂塑型良好,骨折愈合,B组仅有小部分达到骨连接(表2)。表2移植后骨连接情况只

2.4组织学检查A组第12周移植骨两端骨小梁生长良好,骨皮质浅层及深层骨陷窝内骨细胞存活,炎症细胞浸润不明显,血管管腔通畅;B组骨连接处纤维组织增生,移植骨未见存活骨细胞,淋巴细胞、浆细胞浸润明显(图1)。

A:深低温冷冻移植兔骨小梁连续,骨皮质浅、深层骨陷窝内骨细胞存活,炎症细胞浸润不明显,血管管腔通畅; B:新鲜移植兔骨小梁不连续,纤维组织增生,骨皮质浅、深层骨陷窝内未见存活骨细胞,淋巴细胞、浆细胞浸润明显,血管管腔不通畅.图1造模12周兔桡骨段移植骨连接处光镜观察(HE染色×200)

3讨论

IFNγ是移植排斥反应中起重要作用的细胞因子,其是单核/巨噬细胞强有力的激活剂,诱导MHCⅡ类抗原表达,参与抗原递呈和特异性免疫识别过程,直接促进T、B细胞分泌抗体,抑制淋巴细胞,尤其是TH2细胞,抑制其IgE的转换和IgEFC段受体表达,从而抑制I型超敏反应,促进CD4+T细胞黏附和形态改变,以利于淋巴细胞移出血管外。IFNγ在血清或血浆、细胞中转录和翻译水平与急性移植排斥反应的产生、强烈程度有密切关系,是急性移植排斥反应的重要检测指标[4]。在器官移植中,IFNγ水平的检测可作为判定移植物发生排斥反应的依据。本试验中新鲜移植组IFNγ值大于深低温冷冻组,说明新鲜移植组排斥反应较深低温冷冻组强烈。深低温冷冻组IFNγ值又大于无移植对照组,说明深低温冷冻仅能部分降低排斥反应,并不能完全避免排斥反应的发生。

树突状细胞(DC)是一类重要的专职抗原提呈细胞,抗原递呈效率高,少量抗原和少数DC即足以激活T细胞,在机体免疫应答中起重要作用。树突状细胞对冷冻敏感,冷冻不仅使供体器官组织得以保存,而且在冷冻和解冻过程中能选择性杀伤与排斥反应相关的树突状细胞,从而降低器官的移植排斥反应。此外,深低温冷冻破坏了细胞表面的抗原结构,虽不能完全消灭其抗原性,却可以大大降低其抗原性,使移植后的排斥反应显著降低[5]。本试验中组织学观察,新鲜移植骨未见存活骨细胞,炎性细胞浸润明显,而深低温冷冻移植骨陷窝内骨细胞生存良好,炎性细胞浸润不明显,证实了深低温冷冻后移植骨的排斥反应明显降低。

免疫学与形态学研究显示,移植物的微血管床是排斥反应的主要靶组织,血管内皮细胞因表达MHCⅡ类抗原,抗原性强,而且血流较慢,是首先排斥的靶细胞。免疫排斥反应 会导致血管内皮细胞的坏死脱落,血管平滑肌增生,管腔狭窄,甚至栓塞,移植骨段骨细胞死亡,并影响受区两端新生血管的长入,导致移植骨延迟愈合或不愈合。因此,维持吻合血管的通畅是影响移植成功的重要因素[3]。深低温冷冻破坏了细胞表面的抗原结构,使血管内皮细胞坏死脱落与再生保持相对的平衡状态,利于血管内皮的修复,保持血管的通畅,以保障骨的血供。本试验中,深低温冷冻移植骨的骨痂生长及骨连接速度明显优于新鲜移植骨,与吻合血管的通畅有密切的关系。

深低温冷冻技术破坏了细胞表面的抗原结构,大大降低其抗原性,使移植后的排斥反应显著降低。特别是保护移植物的血管床,保证血管的通畅,为移植骨提供血液供应,保障移植骨迅速生长,在最短时间达到骨连接。此外,排斥反应的强弱对移植物的存活至关重要,深低温冷冻处理后的移植骨抗原性下降,排斥反应较小,比新鲜移植骨更易存活。

参考文献：

[1]Rees DC,Haddad FS. Bone transplantation[J]. Hosp Med, 2003,64(4):205209.

[2]Vossen M,Edelstein J,Majzoub R,et al.Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine based immunosuppression therapy[J]. Plast Reconstr Surg, 2005,115(2):529538.

[3]解先宽,顾洁夫,蔡林. 深低温冷存的吻合血管同种异体长骨移植的实验研究[J]. 中国矫形外科杂志, 2002,9(7):678681.

[4]Blancho G,Gianello PR,Lorf T,et al. Molecular and cellular events implicated in local tolerance to kidney allografts in miniature swine[J]. Transplantation, 1997,63(1):2635.

[5]周建生,胡汝麒,潘功平,等. 吻合血管的同种异体肋骨移植实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志, 1996,10(4):210213.

基金项目: 福建省自然科学基金资助课题(C0210016)

作者单位: 福建医科大学 附属协和医院骨科, 福州350001