细胞培养试剂、冷冻和复苏

细胞培养基 市场上可提供干粉培养基和液体培养基： 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制； 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类： RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、 M199、F10等 1000 ml RPMI 1640培养基 RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包） 蒸馏水 400ml ↓ 磁力搅拌至完全溶解 ↓ 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200 ml/瓶，-20℃保存备用。 用前取一瓶溶解，每200 ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100 U/ml。 ↓ 细胞培养液 血清 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物： — 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000 rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 — 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清 平衡盐液体 组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分，用于洗涤组织、细胞等 PBS（Phosphate-Buffered Sallines）： KCl 0.20g KH2PO4 0.20g NaCl 8.00g Na2HPO4•7H2O 2.16g DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型 CaCl2(无水氯化钙) 0.10g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2·6H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2HPO4·7H2O 2.16g D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g 消化液：分离组织和分散细胞 — 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 — 单独或混合使用 胰蛋白酶溶液 — 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 — 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 — 胰蛋白酶溶液配制 1、称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 2、次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右 EDTA·4Na 溶液 — 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，毒性小，价格低廉，使用方便 — 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 — EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存 pH 调整液 — NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 — HEPES（分子量238.31）溶液 1、一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 2、主要作用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 3、使用终浓度一般为10-50mmol/L 4、常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L 谷氨酰胺补充液 — 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加 — 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内，使用终浓度为1-4 mmol/L。 — 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200 mmol/L（29.22 g/L） — 配制方法为 ： 谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100 ml 培养液中加入0.5-2 ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4 mmol/L 酚红 — 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示： 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH； — 在一些特殊培养液中不含酚红： 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用 抗生素溶液 — 抗生素使用种类与浓度： 抗生素 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin(青霉素) 100 u/ml -20℃ G(+) streptomycin(链霉素) 100 ug/ml -20℃ G(+) 、G(-) gentamicin(庆大霉素) 50 ug/ml -20℃ G(+)、G(-)、支原体 amphotericin B(潮霉素B) 2.5 ug/ml -20℃ 真菌 nystatin(制霉菌素) 50 ug/ml -20℃ 真菌 哺乳动物细胞冷冻保存 — 冷冻保存要点： 1、冷冻过程要缓慢 4℃ 30－60 分钟 ↓ -20℃ 30 分钟 ↓ -80℃ 16－18 小时（或过夜） ↓ 液氮长期保存 2、冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 3、细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 — 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） 10％甘油＋ 完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） 冷冻保存细胞的解冻与复苏要点 — 快速解冻 1 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3 分钟）； 2 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO； 3 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中 — 解冻冷冻保存细胞的离心方法 1 从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻； 2 将1－2ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀 3 用80g 离心2－3 分钟，弃上清液 4 用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞 5 接种细胞到培养瓶中，起始密度为3×105/ml。